DOI: S0100-7203(13)03500500007 - volume 35 - Maio 2013
Gisele Rodrigues de Oliveira, Valdimara Corrêa Vieira, Maria Fernanda Martínez Barral, Vanessa Döwich, Marcelo Alves Soares, Carla Vitola Conçalves, Ana Maria Barral de Martinez
Introdução
O papilomavírus humano (HPV) é a infecção sexualmente transmissível mais comum em todo o mundo1. Infecta o epitélio de seres humanos, podendo persistir de forma assintomática ou causar neoplasias2. No mundo estima-se que o número de mulheres infectadas pelo HPV chega a 291 milhões3. Nos EUA, um estudo estimou prevalência de 26,8% em mulheres com idades entre 14 e 59 anos4. No Brasil, a prevalência geral de infecção do colo do útero pelo HPV varia entre 13,7 e 54,3%5. Entre os mais de 140 genótipos identificados, mais de 40 infectam o trato genital dos seres humanos e estão divididos em HPV de alto e baixo risco, dependendo do seu potencial oncogênico. Os HPVs 16 e 18 são os genótipos de alto risco oncogênico, causando aproximadamente 70% dos cânceres cervicais invasivos6.
Entre os fatores de risco para a infecção pelo HPV, os mais relevantes são: ser mulher jovem sexualmente ativa, grupo este que apresenta as taxas mais altas de prevalência da infecção viral, entre 50 e 80% após dois a três anos do início da atividade sexual7; o número de parceiros sexuais durante a vida e a idade do parceiro masculino em relação à da mulher, quanto maior essa diferença, maior o risco8.
Nas gestantes, estudos demonstram haver maior frequência de infecção por HPV quando comparadas às não gestantes. Durante a gestação ocorre imunomodulação característica deste período, aumentando os casos de HPV9,10. Mulheres infectadas pelo HIV-1 são particularmente suscetíveis à infecção pelo HPV, com prevalências elevadas comparadas às gestantes HIV-1 negativas11.
A presença do HPV é condição necessária, porém não suficiente para desenvolver câncer cervical. Sabe-se que 99,7% das mulheres com câncer de colo de útero estiveram expostas ao vírus em algum momento de suas vidas12. Segundo o Instituto Nacional de Câncer (Inca)13, o câncer do colo do útero é o segundo tumor mais frequente na população feminina e a quarta causa de morte de mulheres por câncer no Brasil. Por ano, este tipo de câncer apresenta 18.430 novos casos e faz 4.800 óbitos. Para 2012 foram esperados 17.540 novos casos de câncer cervical. No Rio Grande do Sul, o risco estimado é de 14 casos a cada 100.000 mulheres. Pelas presentes circunstâncias expostas, o objetivo do presente estudo foi determinar a prevalência do HPV e os genótipos mais frequentes e identificar os fatores associados à infecção em mulheres, gestantes e não gestantes HIV-1 positivas e negativas, atendidas em Ambulatórios de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital Universitário e em Unidades Básicas de Saúde (UBS) da região Sul do Brasil.
Métodos
Pacientes
Foi realizado um estudo de tipo transversal entre 2010 e 2011. Participaram do estudo 302 mulheres com mais de 14 anos que concordaram em assinar o termo de consentimento livre e esclarecido. Para participantes com menos de 18 anos, os responsáveis legais foram encarregados de assinarem o termo. Dois tipos diferentes de locais de recrutamento foram utilizados para o estudo: 149 pacientes foram atendidas nos Ambulatórios de Ginecologia e Obstetrícia e outras 153 foram recrutadas em 3 UBS. Destas, 96 eram gestantes HIV-1 negativas e 24 positivas, 162 não gestantes HIV-1 negativas e 20 positivas. Foram excluídas as mulheres cujas amostras não tinham material suficiente à extração de DNA. Todas aquelas incluídas no estudo responderam a um questionário autoaplicável padronizado a fim de conseguir informações sociodemográficas (cor da pele, idade, escolaridade, renda e estado civil) e ginecológicas (idade da primeira relação sexual, número de parceiros sexuais na vida, de gestações e de partos e realização do exame citopatológico) e dados laboratoriais, tais como resultados de exame citopatológico. Os dados sobre a carga viral no plasma e linfócitos T CD4 + em pacientes HIV-positivos foram obtidos pela análise de prontuário médico. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa na Área da Saúde (sob processo 2533/7-74 e pelo 013/2011).
Para que as análises sobre prevalência e fatores de risco associados tivessem poder estatístico, o número de pacientes necessários para o estudo foi calculado utilizando o programa Epi-Info, versão 6.04®. Com base nas referências encontradas na literatura que variam de 1314 a 23%15 de prevalência para encontrar uma prevalência de 18% (IC95%) e uma possível perda de 13%, seriam necessárias amostras cervicais de no mínimo 226 mulheres. As amostras de células cervicais das mulheres incluídas na pesquisa foram coletadas pela ginecologista durante a consulta ginecológica, com o auxílio de uma escova Vagispec®, para posteriores análises molecular e citológica. Para análise molecular, as amostras foram condicionadas em tubos criogênicos contendo 1 mL de tampão T.E. (10 mM Tris-HCl pH=8,5; 1 mM EDTA) e encaminhadas ao laboratório de biologia molecular até a etapa de extração do DNA viral. A análise citopatológica foi realizada como procedimento de rotina do laboratório de patologia, e os resultados obtidos foram posteriormente comparados àqueles com detecção molecular do vírus.
Detecção molecular do HPV e genotipagem
A extração do DNA das amostras coletadas foi feita a partir do kit comercial GFX (GE Healthcare) Genomic Blood DNA Purification Kit, segundo o protocolo de extração das células sanguíneas. Para detecção do HPV, realizou-se uma PCR aninhada. O primeiro round foi realizado com os primers externos: MY09/MY11: 5'CGTCCMAARGGAWACTGATC3'/ 5'GCMCAGGGWCATAAYAATGG3'16, o qual amplifica um fragmento de 450 pb da região L1 do capsídeo viral. O segundo round aconteceu com os primers internos: GP5/6: 5'TTTGTTACTCTGGTAGATAC3' e 5'GAAAAATAAACTGTAAATCA3'17, amplificando um fragmento de 150 pb também da região L1. As condições da reação para o primeiro round foram constituídas por 40 ciclos subsequentes de 94º C por 30 segundos para desnaturação, 45º C por 30 segundos para o anelamento e 72º C por 30 segundos para extensão. Para o segundo round, 40 ciclos subsequentes de 95, 55 e 72º C todos por um minuto, para desnaturação, anelamento e extensão, respectivamente. O amplicon foi visualizado em gel de agarose 1 e 2%, respectivamente, para o primeiro e o segundo round, após ter sido banhado em brometo de etídio (10 mg/mL) e observado sob luz ultravioleta.
A genotipagem do HPV foi realizada por sequenciamento do produto de PCR na Divisão de Genética do Inca Rio de Janeiro. Para esse processo, os produtos de PCR foram purificados com o kit Illustra™ GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification (GE Health Care) e, em seguida, sequenciados com o kit ABI Prism®BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (AppliedBiosystems®, Foster City, USA) em um sequenciador automático ABI 3130XL (Life Technologies). Os genótipos foram determinados comparando-se a sequência consenso com outras referências depositadas em bancos de dados de DNA em busca pelo software BLAST (BLASTn). Para a edição e o alinhamento das amostras, foram utilizados os programas SeqMan e EditSeq do pacote DNAStar (LaserGene Inc., Madison, USA) e BioEditSequenceAlignment Editor©.
Análise estatística
Foram utilizados os programas do software Statistical Package for the Social Sciences (SPSS), prevendo a realização da análise bruta, do cálculo da razão de prevalência, dos intervalos de confiança e do valor de p, considerando que as diferenças foram estatisticamente significativas quando p<0,05 e utilizado o teste exato de Fisher ou do χ2. As variáveis analisadas foram: sociodemográficas, ginecológicas e laboratoriais. A análise multivariada foi realizada no Programa SPSS por meio da regressão de Poisson, sendo seguido um modelo hierarquizado de análise, no qual foram integradas as variáveis com p=0,20 na análise bruta. No primeiro nível ingressaram as variáveis sociodemográficas e no segundo, ginecológicas e laboratoriais.
Resultados
A prevalência do HPV foi de 18,2% (55 pacientes) do total de mulheres que participaram no estudo. Entre as 153 pacientes atendidas nas UBS, 28 (18,3%) foram positivas para o vírus e 27 (18,1%), dentre as 149 pacientes, nos Ambulatórios de Ginecologia e Obstetrícia. Não houve diferença significativa na prevalência do HPV entre os diferentes locais de recrutamento das pacientes.
A média de idade das mulheres incluídas neste estudo foi de 32,7 anos (DP±13,6); 66,9% eram consideradas brancas; 65,6% viviam com um único companheiro; 46,6% tinham oito anos ou menos de escolaridade e 88,1% tinham renda de um salário mínimo ou mais. Do total, 71,5% tinham idades iguais ou inferiores a 17 anos na primeira relação sexual, 46,4% eram gestantes; 49,7% tinham mais de um filho, 79,8% já haviam realizado o exame citopatológico, 95,8% apresentavam células normais no exame citopatológico no momento do estudo e 62,5% das pacientes HIV-1 positivas apresentavam a contagem de CD4 igual ou maior a 350 células/mm3. Entre as variáveis sociodemográficas associadas à presença do HPV, a única que mostrou significância estatística foi a idade. Pacientes com idades iguais ou inferiores a 20 anos apresentaram maior prevalência da infecção quando comparadas àquelas de maior idade (p=0,002). Com relação às características ginecológicas das pacientes, observou-se associação significativa entre o início precoce da vida sexual (idade <17 anos), com p=0,04, ausência de exame citopatológico (p=0,01) e diagnóstico de lesão intraepitelial de baixo ou alto graus (p=0,001). Dentre as pacientes, a multiparidade constitui-se fator de proteção para a infecção pelo HPV (p=0,01), como observado na Tabela 1.
Entre as pacientes HIV-1 positivas, realizou-se a dosagem de células T CD4+. A contagem igual ou menor a 349 células/mm3 teve uma associação significativa com a infecção pelo HPV (p=0,05), não acontecendo a mesma coisa quando comparadas as cargas virais plasmáticas de HIV-1 nestas pacientes (Tabela 1). Os resultados do exame citopatológico se mostraram normais em 272 (95,8%) e com alterações intraepiteliais de baixo ou alto grau em 12 (4,2%) pacientes.
No modelo final realizado com uso da análise multivariada, demonstrou-se que o maior risco de infecção pelo HPV está associado à pacientes com idades <20 anos (IC95% 1,0 - 7,7, p=0,04) e aquelas com o resultado do citopatológico alterado (IC95% 3,0 - 4,1, p=0,001), como visto na Tabela 2.
Quarenta e sete amostras (85,4%) do total das 55 incluídas no estudo foram genotipadas. Em cada uma houve apenas um genótipo por infecção. Os resultados encontrados por sequenciamento foram: oito HPV 16 (17%); oito HPV 58 (17%); seis HPV 6 (12,7%); quatro HPV 18 (8,5%); quatro HPV 33 (8,5%); três HPV 53 (5,4%); três HPV 82 (6,3%); dois HPV 83 (4,2%); dois HPV 61 (4,2%), e os demais, um caso com frequência de 2,1% cada.
Quando comparados os genótipos do HPV com os exames citopatológicos, entre todas as pacientes infectadas pelo HPV 16 cinco (62,5%) apresentaram citopatológico sem alterações intraepiteliais e três (37,5%), citopatológico com alterações intraepiteliais de baixo e alto grau. Já para o HPV 18, três delas (75%) tiveram citopatológico sem alterações intraepiteliais e uma (25%) apresentou o citopatológico com alterações intraepiteliais de baixo e alto grau.
Discussão
A prevalência do HPV neste estudo foi de 18,2% (55/302). No Brasil, foram encontrados resultados similares que detectaram 18,3%, em João Pessoa, Paraíba18, 17,8 e 16,8%, em São Paulo, São Paulo12,19.
Quando comparada a prevalência do HPV entre as pacientes atendidas nas UBS e no Hospital Universitário, não houve diferença significativa. Esse resultado junto às variáveis analisadas em ambos os grupos sugere que as populações atendidas pelas UBS e pelo Hospital Universitário possuem as mesmas características, tanto sociodemográficas como comportamentais, mostrando assim a importância da implantação das UBS para evitar a superlotação dos hospitais, o que melhoraria o atendimento para a maior parte da população.
Quando realizada a análise bivariada, o início precoce das relações sexuais mostrou-se um fator de risco para a infecção pelo HPV. Outro estudo demonstrou que tal variável foi um fator importante para o desenvolvimento de neoplasias cervicais20. Em relação ao número de gestações anteriores, os presentes resultados mostraram proteção contra a infecção por HPV em mulheres com maior número de partos o que havia sido relatado21,22.
A infecção pelo HPV foi significativamente mais frequente em mulheres que relataram não terem feito o exame citopatológico. Apesar dos benefícios do exame citopatológico serem conhecidos, a cobertura deste exame ainda é baixa23. A sua realização periódica seria a melhor estratégia para o rastreamento do câncer cervical.
A gestação também foi um fator associado à infecção, pela alta prevalência do vírus nessa população. Acredita-se que a gravidez possa interferir com a infecção pelo HPV devido a alterações imunes e hormonais11. Sabe-se que altos níveis de hormônios esteroides produzem diminuição da síntese e atividade dos linfócitos e macrófagos. Assim, durante a gestação há depressão transitória e seletiva da imunocompetência celular. A atividade dos linfócitos T auxiliares e T supressores está diminuída, assim como da IgG e IgA no muco cervical10.
Já foi demonstrada a relação entre as infecções pelos vírus HPV e HIV-124,25, maior prevalência do HPV em mulheres HIV-1 positivas. No presente estudo, a frequência de infecção pelo HPV entre as gestantes HIV-1 positivas (29,2%) foi mais elevada em comparação com as negativas e as não gestantes HIV-1 negativas e positivas. Esse fato pode se dever à imunomodulação característica durante o período da gestação, ocasionando um aumento dos casos de HPV9. A associação entre a infecção pelo HPV e as mulheres infectadas pelo HIV-1 está bem documentada e, para este grupo, há maior prevalência de HPV de alto risco, persistência e recorrência, quando comparadas com HIV-1 negativas24.
As pacientes HIV-1 positivas com a contagem de CD4 <349 células/mm3 mostraram associação positiva com a infecção pelo HPV. Já observou-se que a detecção de DNA do HPV está associada com níveis mais baixos de linfócitos T CD4+ e cargas virais mais elevadas do HIV-126.
No entanto, na análise multivariada, notou-se que apenas as variáveis que persistiram associadas significativamente à infecção pelo HPV foram a idade e o exame citopatológico alterado. As mulheres com idades <20 anos tiveram maiores chances de estar infectada pelo HPV quando comparadas com outras faixa etárias. Neste estudo, a prevalência da infecção pelo HPV nessa população foi de 34,4%, valor este muito superior ao encontrado na amostra geral. Vários trabalhos constataram a infecção em mulheres mais jovens27-29. Adolescentes são consideradas mais suscetíveis à infecção pelo HPV e as lesões precursoras do carcinoma cervical progridem mais rapidamente em mulheres jovens. Esses fatos estariam relacionados ao baixo uso de métodos de barreira, a imaturidade imunológica sistêmica e cervical em diferenças biológicas e/ou fisiológicas no epitélio cervical30. Dessa forma, mais estudos são necessários para se compreender quais são os mecanismos fisiológicos/biológicos envolvidos na história natural da infecção pelo HPV em mulheres mais jovens.
Apesar da população de adolescentes ser considerada de maior risco para portar o HPV, os exames de rastreio neste grupo são menos frequentes do que entre as mulheres adultas. Por isto, sugere-se direcionar projetos de educação em saúde neste grupo para se divulgar não só a importância e a finalidade do exame citopatológico, mas também o uso de preservativos e o controle dos parceiros sexuais, relacionando tais condutas à prevenção do câncer de colo uterino.
O genótipo das amostras cervicais de 47 pacientes foi determinado no presente trabalho. Entre aqueles de alto risco encontrados, os mais prevalentes foram o HPV 16, 58, 18 e o 33, sendo estes também os tipos mais encontrados nos casos de lesões intraepiteliais de baixo e alto grau. Entre os genótipos de baixo risco, o HPV 6 foi o mais prevalente, sendo este um dos virais mais comuns responsáveis pelas verrugas genitais.
Com menor frequência também foram encontrados os genótipos HPV 31, 35, 45, 53, 64, 68, 71, 82, 83 e 85, considerados de alto risco oncogênicos, embora a associação com o câncer cervical seja menos forte em comparação aos tipos 16 e 18, e o 61 de baixo risco4,31.
De acordo com outros estudos, o HPV 16 é o tipo mais prevalente em todas as regiões brasileiras, mas há uma variação em relação aos tipos e regiões. O HPV 18 é o segundo mais prevalente no Norte, Sudeste e Sul do Brasil e os 31 e 33 são os próximos mais prevalentes no Nordeste e Centro do Brasil, respectivamente32. Em um recente trabalho realizado em 18 países, detectou-se em 46,5% dos casos de lesão intraepitelial de alto grau o HPV 16 e em 8,9%, o 18. Nos casos de câncer cervical invasivo foram detectados 53,2% de HPV 16 e 13,2% de 1833.
Em oito amostras não foi possível a identificação do genótipo, que está de acordo com outros estudos. Em um caso-controle, não foi possível identificar por sequenciamento o genótipo viral em 15 casos (23,4%) e em nove amostras (28,6%) o mesmo não foi identificado no Grupo Controle20. Noutro estudo não se identificou o genótipo em três (10%) das mulheres infectadas pelo HIV-1 e em uma (11,1%) daquelas HIV-1 negativas27.
Em relação ao exame citopatológico, a prevalência dos genótipos de alto risco oncogênico foi mais elevada entre os resultados citopatológicos que não mostravam alterações intraepiteliais de alto ou baixo grau. Isso poderia ocorrer devido a limitações importantes nas avaliações citológicas, como resultados falso-negativos advindos de erros na coleta, na preparação e na leitura das amostras citológicas, ou visto que a infecção pelo HPV é um fenômeno progressivo e, dependendo do tempo de infecção, sua presença ainda não foi capaz de causar alterações celulares detectáveis pelos métodos citopatológicos e anatomopatológicos convencionais34. Assim, o exame citopatológico associado à detecção do DNA do HPV por técnicas de biologia molecular é a alternativa para identificar precocemente pacientes com elevado risco de desenvolver câncer cervical35.
Entre as limitações deste estudo podem ser mencionados os vieses de memória e informação, devido às informações serem baseadas em autorrelatos, podendo interferir nos resultados de estudos transversais. Em conclusão, este estudo detectou, por meio da PCR, uma alta prevalência do DNA-HPV em mulheres com idades inferiores a 20 anos, apresentando uma importante associação entre a idade das pacientes e a infecção pelo HPV. A gestação também está relacionada a uma maior frequência de tal enfermidade. Além disso, a genotipagem viral associada à citologia pode ser útil na identificação de mulheres de risco para lesões cervicais mais graves, resultando em uma melhoria na sua detecção.
Recebido 08/03/2013
Aceito com modificações 22/05/2013
Trabalho realizado na Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio Grande - Rio Grande (RS), Brasil.
Conflito de interesse: não há.