DOI: 10.1590/S0100-72032008000400004 - volume 30 - Abril 2008
Ana Maria Furtado-Veloso, Ione Maria Ribeiro Soares Lopes, Pedro Vitor Lopes-Costa, Lina Gomes dos Santos, Benedito Borges da Silva
Introdução
Tamoxifeno, um modulator seletivo do receptor de estrógeno (SERM) de primeira geração, foi a primeira droga aprovada nos Estados Unidos para prevenção do câncer de mama em mulheres de alto risco, após os resultados do National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project P-1 Study, patrocinado pelo Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos1-3. Contudo, o tamoxifeno, quando usado por longos períodos, pode apresentar sérios efeitos colaterais, sendo o mais preocupante a estimulação endometrial, que pode resultar no desenvolvimento de carcinoma do endométrio1. Esta preocupação aumentou o interesse pelo estudo de outros SERMs que poderiam ser uma alternativa ao tamoxifeno4,5.
A propósito, o raloxifeno, um SERM de segunda geração, aprovado nos Estados Unidos e em outros países para prevenção e tratamento da osteoporose em mulheres menopausadas, tem mostrado exercer uma ação antiestrogênica tanto na mama quanto no endométrio de animais de laboratório6,7. Além disto, estudos clínicos em que o raloxifeno foi usado por mulheres menopausadas por um período superior a dois anos mostraram redução da freqüência do câncer de mama sem estimulação endometrial8. Recentemente, estes achados foram confirmados pelo Study of Tamoxifen and Raloxifene (STAR) trial, que mostrou que o raloxifeno foi tão efetivo quanto o tamoxifeno em reduzir o câncer invasivo de mama, com vantagem de não aumentar o risco para carcinoma endometrial9. Contudo, este foi um estudo clínico, sendo o estudo dos efeitos diretos dos SERMS na mama normal difícil de ser realizado por questões de natureza ética4.
Assim, há escassez de estudos na literatura avaliando os efeitos do raloxifeno sobre o tecido mamário normal de mulheres na pré-menopausa4. Todavia, já foi mostrado que o raloxifeno produziu uma redução significante na proliferação do tecido mamário normal de mulheres no menacme, avaliada por meio da expressão do antígeno Ki-67, em comparação com o grupo placebo4. Os mecanismos de proliferação celular e apoptose mantêm o equilíbrio do crescimento normal do parênquima mamário10,11. Contudo, a ação do raloxifeno neste equilíbrio não está clara. Embora o efeito antiproliferativo dos SERMs no câncer de mama possa ser via atividade citostática receptor-mediada, relatos prévios têm sugerido alterações morfológicas consistentes com apoptose12.
A apoptose é regulada principalmente pelas proteínas da família Bcl-2, que consiste de duas subfamílias opostas: uma com atividade antiapoptótica (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w) e outra pró-apoptótica13. A subfamília pró-apoptótica consiste de proteínas tais como Bax, Bak, Bok, Bad, Bid, Bik e Bim13,14. A proteína Bax promove a morte celular e é uma das proteínas mais estudadas da subfamília pró-apoptótica. A apoptose induzida pelo tamoxifeno no câncer de mama está relacionada à supressão da proteína antiapoptótica Bcl-2, mas não se observou alteração da expressão da proteína pró-apoptótica Bax12,15. Por sua vez, o raloxifeno inibe a proliferação celular no tecido mamário normal4, mas o seu efeito na expressão da proteína Bax no tecido mamário normal é desconhecido, o que levou à concepção do presente estudo.
Métodos
Este é um estudo randomizado duplo-cego, que envolveu 33 pacientes com fibroadenoma atendidas no Setor de Mastologia do Hospital Getúlio Vargas da Universidade Federal do Piauí (UFPI). Todas as pacientes eram voluntárias e deram o seu consentimento informado assinado antes do início do estudo. O protocolo deste estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFPI. Todas as pacientes tinham entre 18 e 40 anos de idade e estavam no menacme. Foram realizados os exames clínicos, ultra-sonografia, punção aspirativa com agulha fina e, posteriormente, exame histopatológico do fibroadenoma para excluir malignidade. Todas as pacientes tinham ciclos menstruais regulares há pelo menos seis meses antes de participarem do estudo. As pacientes não tinham qualquer história de doença tromboembólica, gestação, aleitamento ou uso de contraceptivo hormonal nos últimos 12 meses antes do estudo.
Delineamento do estudo
As pacientes foram randomizadas em dois grupos: Grupo Placebo, (n=18) e Grupo Raloxifeno, (n=15). A droga foi administrada na dose de 60 mg ao dia, por 22 dias, começando no primeiro dia do ciclo menstrual. Os Grupos Placebo e Raloxifeno foram considerados homogêneos com respeito à idade (média: 24,5 e 25,5, respectivamente; p=0,6), idade da menarca (média: 12,6 e 13,1, respectivamente; p=0,17) e tamanho do fibroadenoma (média: 3,5 e 4,5 cm, respectivamente; p=0,2). No 23º dia do ciclo menstrual, após confirmação da fase lútea pelo nível sérico de progesterona igual ou superior a 6,5 ng/mL, as pacientes foram submetidas à exérese do fibroadenoma com extração de um fragmento milimétrico de parênquima mamário adjacente ao fibroadenoma, sem inclusão de tecido adiposo ou com alterações morfológicas.
Imuno-histoquímica
As amostras de tecido mamário foram fixadas em formol tamponado a 10%, por 24 horas, e, em seguida, embebidas em parafina. Cortes histológicos medindo 4 µm dos blocos parafinizados foram usados para estudo imuno-histoquímico. A imuno-histoquímica realizada para identificar a expressão do Bax utilizou anticorpo policlonal de coelho anti-Bax humano da Dako, código A3533, na diluição 1:150. Os cortes foram lavados com solução neutra e o polímero marcado com peroxidase foi incubado por 30 minutos à temperatura ambiente. A seguir, após lavagem dos cortes com solução neutra, a reação de peroxidase foi desenvolvida com tetrahidrocloridrato de diaminobenzidina. As células foram consideradas positivas para o antígeno Bax quando o seu citoplasma apresentou coloração marrom.
A expressão da proteína Bax foi avaliada à microscopia de luz por dois observadores que desconheciam a identificação das pacientes. Não houve discordância entre as duas contagens. Estes observadores realizaram uma contagem semi-quantitativa das células com citoplasma corado positivamente usando microscópio óptico Nikon, modelo Eclipse E400, conectado a um sistema de captura de imagem, e usando objetiva de 40X (magnificação 400X).
A imunorreação do Bax foi avaliada segundo os critérios estabelecidos por van Slooten et al.16, levando em consideração os seguintes parâmetros: intensidade de coloração da célula (I) e fração de células coradas (F). A intensidade de coloração das células foi classificada como: 0 (negativo), 1 (fracamente corada), 2 (moderadamente corada) e 3 (fortemente corada). A fração de células coradas foi classificada como: I (0-25%), II (25-75%) ou III (75-100%). O escore final foi o resultado da combinação dos dois parâmetros (I e F) e variou de 0 a 6. Os casos com escore final >3 foram classificados como positivos para a proteína Bax. Em todos os casos, coloração marrom no citoplasma foi adotada como padrão para positividade. A avaliação começou no local com a maior quantidade de células coradas, após a qual os outros campos microscópicos foram selecionados aleatoriamente, e a intensidade de coloração e a percentagem de células coradas foram avaliadas, resultando em um escore final16.
O teste t de Student foi usado para verificar a homogeneidade entre os dois grupos com respeito à idade das pacientes, idade da menarca e volume do tumor (p<0,05). Foi utilizado o teste do c2 para a análise dos dados relativos ao Bax e a significância estatística foi estabelecida em p<0,05.
Resultados
À microscopia de luz, as células do epitélio lobular mamário das pacientes do Grupo Placebo mostraram reação imuno-histoquímica para o antígeno Bax, expressa por numerosas células, contendo citoplasma com intensa coloração marrom, similar ao Grupo Raloxifeno (Figuras 1 e 2). A análise da expressão da proteína Bax mostrou uma positividade em 12 (66,7%) dos casos do Grupo Placebo comparado com 11 (73,3%) dos casos do Grupo Raloxifeno, conforme a Tabela 1. Esta diferença não foi estatisticamente significante (p=0,678). A mediana dos escores nos Grupos Placebo e Raloxifeno foi 5 e 3, respectivamente.
Discussão
O tamoxifeno é comumente usado na terapia adjuvante do câncer de mama e é a droga chave para a quimioprevenção do câncer de mama em mulheres de alto risco1. Contudo, um aumento na incidência do carcinoma endometrial foi previamente relatado com uso da droga por longos períodos1. O STAR trial, estudo recentemente publicado, mostrou que o raloxifeno é tão efetivo quanto o tamoxifeno na redução do carcinoma invasivo de mama, com vantagem de estar associado a menor risco para carcinoma endometrial9. Apesar disto, o raloxifeno ainda não foi aprovado para quimioprevenção do câncer de mama em mulheres de alto risco. O mecanismo de ação do raloxifeno não está claro. A droga inibe a proliferação celular no tecido mamário normal4, mas não sabemos se altera a expressão de proteínas, como o Bax, que promovem a apoptose.
No presente estudo, o raloxifeno foi usado na dose de 60 mg ao dia, por 22 dias, e não se mostrou capaz de alterar a expressão do Bax nas células do tecido mamário de mulheres no menacme comparado ao grupo tratado com placebo. A dose de 60 mg/dia foi escolhida por ser a dose comumente usada na quimioprevenção e tratamento da osteoporose de mulheres menopausadas e também em trials clínicos desta droga na quimioprevenção do câncer de mama. O esquema de 22 dias de uso da medicação por mulheres pré-menopáusicas, começando no primeiro dia do ciclo menstrual, foi escolhido baseado em relatos que a mama apresenta maior atividade proliferativa e apoptótica durante a fase lútea do ciclo10,17 e, por esta razão, é a fase mais importante para o estudo do efeito antiproliferativo4,18 e, possivelmente, antiapoptótico da droga. A avaliação do efeito do raloxifeno no tecido mamário adjacente ao fibroadenoma de mulheres pré-menopáusicas pode beneficiar as pacientes, pois estudos prévios com outro SERM - mais precisamente o tamoxifeno - mostraram redução nas dimensões do tumor avaliado pela ultra-sonografia e, em alguns casos, ocorreu desaparecimento da lesão, evitando-se cirurgia previamente programada19.
O raloxifeno é um SERM benzotiofeno quimicamente distinto do tamoxifeno, que, de maneira similar ao tamoxifeno, interage com o receptor de estrogênio. Contudo, o seu real mecanismo de ação permanece incerto20,21. O tamoxifeno estimula a função de ativação da transcrição gênica 1 (AF-1) do receptor de estrogênio presente nas células do endométrio e bloqueia a função de ativação 2 (AF-2), predominantemente nas células da mama responsáveis pela ligação a moléculas coativadoras necessárias para a transcrição gênica no tecido alvo. Por outro lado, o raloxifeno inativa tanto AF-1 quanto AF-2, resultando em uma ação antiestrogênica tanto na mama quanto no endométrio20,21.
Os efeitos dos SERMs sobre a expressão das proteínas anti- e pró-apoptóticas são intrigantes. A propósito, o efeito do raloxifeno na linhagem de célula TSU-PR1 mostrou indução de apoptose caspase-dependente por meio da clivagem da proteína Bad sem alteração significante na expressão da proteína Bax22. Alguns autores têm mostrado que SERMs, como o tamoxifeno, induziram apoptose nas células do câncer de mama por meio da supressão da proteína Bcl-2, sem, contudo, afetar a expressão da proteína Bax15. A expressão da proteína pró-apoptótica Bax não foi correlacionada com a expressão do Bcl-2 nem com a freqüência de células apoptóticas16. Assim, não estão claros os efeitos dos SERMs nas proteínas relacionadas à apoptose. De acordo com o que foi investigado, não há relatos na literatura a respeito dos efeitos do raloxifeno sobre a expressão da proteína Bax no tecido mamário humano normal. No presente estudo, a porcentagem de células expressando o antígeno Bax foi maior no grupo tratado com raloxifeno, mas esta diferença não foi significante. Assim, pela importância que o raloxifeno poderia ter na quimioprevenção do câncer de mama, estes resultados abrem perspectivas para novas pesquisas, incluindo estudos com maior número de pacientes e, provavelmente, usando a droga por um período de tempo maior, com o objetivo de avaliar os efeitos do raloxifeno em promotores de apoptose no tecido mamário humano normal, como a proteína Bax.
Recebido: 6/4/2008
Aceito com modificações: 29/4/2008
Trabalho realizado no Setor de Mastologia do Hospital Getúlio Vargas da Universidade Federal do Piauí - UFPI - Teresina (PI), Brasil.