DOI: 10.1590/S0100-72032008000500003 - volume 30 - Maio 2008
Alessanda Fernandez Louzada Hoegmann Ramos, Jhennifer Kliemchen Rodrigues, Lorena Ribeiro da Silva, Martha de Oliveira Guerra, Vera Maria Peters
Introdução
Tacrolimus (FK 506, Prograf®) é um antibiótico macrolídeo que apresenta potente propriedade imunossupressora e seu uso clínico é crescente, sendo considerado o medicamento imunossupressor base em mais de 30% dos pacientes que receberam transplantes renais e mais de 80% dos transplantes hepáticos1, sendo também utilizado em transplantes de ilhotas pacreáticas2 e no tratamento de dermatite atópica e vitiligo3.
O tacrolimus atua inibindo a ativação das células T e bloqueando a calcineurina1,4. Entre seus efeitos colaterais, observam-se insuficiência renal aguda e crônica, outras nefropatias e hipoglicemias5. É transferido por meio da placenta6 e seu uso durante a gravidez só é recomendado se o benefício para a mãe justificar o risco potencial ao feto.
As pacientes são aconselhadas a aguardar dois anos após o transplante para tentar a gestação, uma vez que as complicações são mais freqüentes antes do segundo ano de transplante7,8. Foram relatadas gestações em pacientes submetidas a transplante de fígado8 e em uso do tacrolimus, sendo a complicação mais freqüente a prematuridade, observação compartilhada por outros autores7,9. Estudos semelhantes em pacientes com transplante renal notaram a ocorrência de abortos espontâneos e gestações de prematuros10. Embora tenha sido descrito que a taxa de malformação não aumente em recém-nascidos de mães tratadas com tacrolimus7,11, existe relato de 12% de abortos espontâneos em pacientes em uso do imunossupressor12.
Os estudos sobre a toxicidade embrionária e fetal em animais de experimentação evidenciaram efeitos teratogênicos13. Em coelhos, induziu aumento do número de abortos (dose 1,0 a 3,2 mg/kg) e, em ratas tratadas durante o período de organogênese, causou aumento da toxicidade materna e de reabsorções tardias, decréscimo do número de nascimentos vivos e diminuição no peso e na viabilidade dos filhotes14.
Um dos mecanismos de ação do tacrolimus é a inibição da calcineurina15. A calcineurina é um regulador de íon cálcio e está envolvida com processos relacionados à secreção, citocinese, fusão de vacúolos e na integridade celular16. Por alterar proteínas cálcio-dependentes, o tacrolimus poderia potencialmente alterar ou inibir a expressão de caderinas, proteínas que têm papel crítico na regulação da morfogênese, dado seu envolvimento com a adesão, polarização e sinalização celular17. Essa proteína se expressa em concentrações progressivas desde a fase de duas células até blastocisto e tem papel chave na compactação dos blastômeros na fase de oito células18. Estes processos são essenciais no período inicial do desenvolvimento embrionário.
Os estudos em humanos referem-se a abortos12, mas não às perdas pré-implantação que habitualmente não são detectadas. Muitas vezes, tais perdas são associadas à infertilidade e, na literatura consultada, não foram encontrados dados referentes a tais observações. Estudos em humanos, nessa fase, têm óbvias objeções morais, o que faz com que os animais de experimentação sejam utilizados para avaliação do risco potencial para o ser humano, razão que levou à realização do presente trabalho, que teve por objetivo verificar se a administração de tacrolimus na fase inicial da prenhez de ratas altera o desenvolvimento embrionário.
Métodos
Para a realização do experimento, foram utilizadas 60 ratas Wistar, nulíparas, com peso entre 190 e 230 g, obtidas do Biotério do Centro de Biologia da Reprodução da Universidade Federal de Juiz de Fora (CBR-UFJF).
As fêmeas foram inseminadas por machos de fertilidade previamente comprovada e a prenhez foi constatada pela presença de espermatozóides em esfregaço vaginal, realizado na manhã do dia seguinte ao acasalamento, sendo este dia considerado o primeiro dia pós-inseminação.
Os animais inseminados foram colocados isoladamente em gaiolas de polipropileno, forradas com maravalha selecionada e alojados em estantes climatizadas, em ambiente com luminosidade controlada para ciclos de claro/escuro de 12 horas, conforme descrito anteriormente. Receberam diariamente água filtrada ad libitum e 25 g/animal de ração peletizada (Nuvilab®)19.
As ratas foram distribuídas aleatoriamente em quatro grupos experimentais, com 15 animais em cada grupo. Os animais do grupo controle (C) receberam 1 mL de água destilada e os animais dos grupos tratados receberam tacrolimus (Prograf®, Janssen-Cilag Farmacêutica Ltda., lotes 5C51133A) nas doses de 1 mg/kg/dia (T1), 2 mg/kg/dia (T2) e 4 mg/kg/dia (T3) diluídos em água destilada. A menor dose foi a mesma utilizada por Ochiai et al.20 para manutenção do transplante em ratos. A administração foi feita por via intragástrica duas vezes ao dia, com intervalo de 12 horas, desde o primeiro até ao quinto dia pós-inseminação.
Para observação de sinais clínicos indicativos de toxicidade materna21, as ratas foram observadas durante 30 minutos e seis horas após o tratamento e, posteriormente, uma vez ao dia. A toxicidade materna foi avaliada por presença de pêlos eriçados, hipoatividade ou hiperatividade no interior da gaiola, presença de sialorréia, diarréia ou mortes. O consumo de ração foi estimado, conforme descrito anteriormente19, desde o primeiro até ao 15º dia pós-inseminação. O peso corporal materno foi anotado no primeiro e no último dia de tratamento e também no dia em que os animais foram sacrificados.
Os animais foram mortos no 15º dia pós-inseminação por exsangüinação sob anestesia (ketamina+xilazina, via intraperitoneal, 0,3 e 0,6 mL, respectivamente). O sangue colhido foi destinado a outro experimento.
Em cada animal, procedeu-se à observação de órgãos internos para identificação de lesões macroscópicas e à remoção e pesagem de fígado e rins maternos. Os ovários foram dissecados, pesados e neles contados os corpos lúteos. Os cornos uterinos foram secionados longitudinalmente para identificação e contagem do número de implantes, de fetos vivos e mortos. Os fetos eram considerados vivos quando se identificaram batimentos cardíacos, observados sob estereomicroscópio. Foram anotados também pesos de placentas e de fetos por ninhada. Calculou-se a taxa de implantação: (número de implantes/número de corpos lúteos)x100 e a atividade antiimplantação22. Para análise de morfogênese, os fetos foram colocados em fixador de Bouin, durante 60 minutos, e depois foram examinados sob microscópio estereoscópico para identificação de malformações na face, nos membros e no fechamento do tubo neural.
O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética na Experimentação Animal (CEEA) da UFJF (nº 035/2005).
Os dados contínuos, com distribuição normal e homocedasticidade da amostra, foram submetidos à análise estatística pelo testes de análise de variância (ANOVA), seguido de teste de Dunnett. Proporções foram avaliadas pelo χ2. O nível de significância admitido para os testes foi α=0,05.
Resultados
Não foram encontrados indícios clínicos de toxicidade materna em nenhum dos grupos examinados. O consumo médio de ração (C: 16,6±1,6 g; T1: 16,8±0,9 g; T2: 18,3±1,7 g; T3: 17,9±1,8 g) apresentou diferença significativa (p>0,05) entre os grupos T2 e C, mas sem significado biológico.
Conforme mostrado na Tabela 1, foram encontrados, para os grupos C, T1, T2 e T3, respectivamente, os pesos médios: corporal (g): 204,9; 206,3; 210,4 e 210,2; de fígado (g): 9,2; 8,9; 9,2 e 9,2; de rins (g): 1,5; 1,5; 1,6 e 1,8; de ovários: 75,7; 110,1; 77,3 e 77,1; e médias de: corpos lúteos/mãe: 12,3; 12,1; 13,6 e 13,7; implantes/mãe: 11,7; 10,3; 12,0; 11,3; de fetos vivos/mãe: 10,4; 9,5; 11,1 e 10,5; taxa de implantação/grupo (%): 95,9; 86,3; 88,3 e 82,0, não havendo diferença significativa entre quaisquer das variáveis analisadas (p>0,05).
Os pesos corporais dos fetos e da placenta não diferiram entre os grupos (p>0,05), tendo sido observado para os Grupos C, T1, T2 e T3, respectivamente, médias de peso corporal (g) de 1,8; 2,2; 1,9 e 2,0 e de placenta (g) de 1,6; 1,5; 1,8 e 1,6.
Não foram detectadas alterações na morfogênese externa dos fetos em nenhum dos animais dos grupos estudados.
Discussão
Os estudos sobre toxicidade reprodutiva estão regulamentados por diversos órgãos, como Organization for Economic Co-operation and Development23, guideline nº 421, e International Conference on Harmonisation24, guideline S5, para teste de substâncias químicas.
Os protocolos indicam a necessidade de se distinguir entre toxicidade materna, que eventualmente possa interferir no desenvolvimento embrionário, e lesões diretas sobre o feto. Habitualmente, os indícios de toxicidade materna são a presença de perda de peso corporal, acompanhada ou não de redução do consumo de alimentos, os pêlos eriçados, além de alterações de peso de órgãos25, fatores que não foram detectados entre os grupos estudados o que sugere que o tacrolimus não teve efeito tóxico sobre o organismo materno.
A relação entre corpos lúteos e implantes permite calcular o índice de blastocistos implantados e os que não se implantaram; correspondem, portanto, às perdas pré-implantação22. Pelos resultados apresentados, as taxas de implantação foram semelhantes (p>0,05) entre os grupos experimentais estudados e, conseqüentemente, as perdas pré-implantação também foram semelhantes. Tais dados permitem sugerir que o tacrolimus não causou perdas de embriões na fase de desenvolvimento nas tubas uterinas.
O tacrolimus não parece interferir na expressão de caderinas, essenciais na regulação da morfogênese e na compactação para formação da mórula17, já que não se observaram perdas embrionárias, mortes pós-implantação que se refletissem no número de fetos vivos, na taxa de implantação e, tampouco, alterações da morfogênese externa. Não houve possibilidade de comparação de nossos resultados com outros autores, uma vez que, na literatura consultada, não foram encontrados estudos sobre o efeito do tacrolimus no início da prenhez de animais de experimentação.
Em conclusão, no modelo experimental utilizado no presente trabalho, o tacrolimus não causou toxicidade materna ou embrionária, quando administrado durante o período de pré-implantação.
Agradecimentos
Apoio financeiro: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (Fapemig), CDS 1840-06 e REDES 2824/05 e 2827/05.
As autoras agradecem ao doutor Carlos Alberto Mourão Júnior, pela análise estatística dos resultados; o apoio técnico dos bolsistas da Fapemig, Marcella Martins Terra, Maria das Graças Nascimento e Nádia Vieira Rangel; e às professoras Luciana Valente Borges e Rosana de Paiva Oliveira, pela leitura crítica do texto.
Recebido: 18/3/08
Aceito com modificações: 9/5/08
Auxílio financeiro: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), Cds 1840-06 E Rede 2824/05 E 2827/05.
Centro de Biologia da Reprodução da Universidade Federal de Juiz de Fora UFJF Juiz de Fora (MG), Brasil.